28 ноября экипажи старшего лейтенанта Л. Пузанова и лейтенанта В. Стрельцова вылетели на прикрытие железнодорожного узла Александров. Им удалось перехватить три немецких бомбардировщика Ju 88, пытавшихся пробиться к станции, используя облачность. Встретившись в воздухе с советскими истребителями, немцы бросились врассыпную. Пузанов быстро сбил одного "юнкерса". Стрельцов решительно атаковал второго, но здесь ситуация сложилась более сложной. Во второй атаке лейтенант зажег мотор Ju 88. Третья атака оказалась последней для немца, но пилот Пе-3 был ранен, а осколками стекла, разбитого пулей с "юнкерса", Стрельцову повредило глаз. Пользуясь подсказками штурмана, летчик сумел привести истребитель на аэродром и посадить его. Уже на пробеге Стрельцов потерял сознание.

В ноябре 1941 г. командиром 95-го иап был назначен майор Жатьков, уничтоживший в воздушных боях несколько самолетов противника.

Осенью на "тройках" выполнили доработки, установив в носовой части фюзеляжа пушку ШВАК и заменив пулемет штурмана крупнокалиберным БТ. Часть самолетов оснастили реактивными орудиями РО-82 (по 8 штук), а на некоторые, кроме того, смонтировали еще по два РО-132. Стрелять можно было сериями залпов по 2 или 4 реактивных снаряда. Несколько машин доработали, установив на них аэрофотоаппараты АФА-Б. Пе-3 несли напряженную боевую службу в системе ПВО Москвы вплоть до марта 1942 г. Воду из моторов не сливали даже в самые морозные ночи, поскольку полк считался истребительным, и команда "на взлет" могла быть получена в любую минуту. И все же главной задачей 95-го иап в декабре-январе оказалась бомбардировка немецких войск.

Только за эти два месяца самолеты полка сбросили на головы врага более полутора тысяч бомб. Кроме того, нередко часть привлекалась для ведения авиационной разведки.

Приказом Наркома обороны от 1 марта 1942 г. 95-й иап был передан в состав ВВС Северного флота. 5 марта большая группа летчиков и штурманов полка получила ордена (в том числе командир полка майор А. Жатьков и его штурман капитан Н. Морозов — ордена Ленина).

Спустя еще два дня полк вылетел на Север.

С первого дня войны, вооруженный самолетами СБ, 208-й сбап оказался в самой гуще сражений. Накал боев оказался столь велик, что к концу июля шестиэскадрильный полк (одна из эскадрилий уже после начала войны была укомплектована командирами из академии командно-штурманского состава) потерял 55 самолетов и 38 экипажей. В соответствии с приказом Командующего ВВС от 4 августа 1941 г. на основе полка были созданы три, но уменьшенного двухэскадрильного состава (по 20 самолетов в полку). Один из них, сохранивший прежнее наименование, приступил к переучиванию на истребители Пе-3.

С 15 октября 208-й сбап под командованием майора Коломейцева приступил к ведению боевых действий в составе 6-го истребительного авиакорпуса. Задачей полка было, главным образом, прикрытие железнодорожных станций и мест погрузки-выгрузки войск в районе Москвы. Кроме того, он привлекался и к нанесению бомбо-штурмовых ударов. Всего за три месяца боев самолеты 208-го сбап (его наименование не менялось, в отличие от 95-го полка) совершили 683 боевых вылета, уничтожив (по докладам экипажей) 34 танка, 212 автомашин, 6 железнодорожных эшелонов и 33 самолета противника. Собственные безвозвратные потери составили 10 Пе-3, в сражениях погибли 12 летчиков и 9 штурманов. За участие в обороне Москвы полк получил благодарность от командующего Западным фронтом генерала армии Г.К. Жукова.

В связи с острой нехваткой самолетов Пе-3 (московский авиазавод № 39 эвакуировался в Иркутск и временно прекратил выпуск двухмоторных истребителей) командир 6-го авиакорпуса полковник Мительков приказал передать оставшиеся в 208-м полку 12 самолетов в 95-й иап. 19 января 1942 г. 208-й сбап убыл с фронта для переучивания на штурмовики Ил-2.

Вооруженный первоначально бомбардировщиками СБ, 40-й сбап, воевавший с первого дня войны, начал перевооружение на Пе-2 и Пе-3 в сентябре 1941 г. В том же месяце полк прошел переформирование, выделив из своего состава полк "40-А", впоследствии 511-й ближнебомбардировочный авиаполк (ббап). В периоде 22 по 24 сентября самолеты 40-го сбап нанесли ряд массированных ударов по железнодорожному узлу Старая Русса и вывели его из строя на неделю. Три вылета полка 27 и 28 сентября на бомбардировку станции Рославль приостановили движение немецких эшелонов на 2-3 дня. В числе наиболее заметных успехов полка стоит отметить разрушенный мост через реку Угра в районе Юхнова (командир эскадрильи капитан А.Г. Рогов получил за него звание Героя Советского Союза) и поврежденный мост через Волгу в районе Калинина, что затруднило маневр германских танковых соединений. Цена, которую заплатил полк за успехи, также оказалась немалой: 6 октября 1941 г. не вернулись на свои аэродромы пять экипажей Пе-3, 8 октября пропал без вести в районе Юхнова-Медыни комэск А.Г. Рогов, а четыре дня спустя — второй комэск, капитан В.Б. Малофеев.

В период битвы под Москвой полк, вооруженный преимущественно Пе-3, использовался для нанесения бомбовых ударов и разведки. Он выполнил 365 самолето-вылетов и сбросил на врага 218 тонн бомб. 15 декабря 1941 г. полк был преобразован из скоростного бомбардировочного в авиационный полк разведчиков Главного Командования Красной Армии (40-й апр ГК КА), а позднее получил более привычное наименование — 40-й дальний разведывательный авиационный полк (драп). Экипажи проходили переучивание, не выходя из боев.

Теперь они стали "глазами" Ставки Верховного Главнокомандования и вели стратегическую разведку на широком фронте от предгорьев Кавказа до Калинина.

Самолеты полка регулярно появлялись над крупнейшими немецкими аэродромами Сеща, Олсуфьево, Брянск и Орел, отслеживали движение железнодорожных эшелонов в глубине оккупированной территории. В период подготовки операции на окружение 6-й немецкой армии в районе Сталинграда полк участвовал в сплошном фотографировании оборонительных позиций немецких, румынских и итальянских войск, в результате чего была разработана единая фотокарта всего района, предназначенная для высшего военного руководства.

Личный состав полка выполнил ряд доработок на своих машинах в интересах повышения их обороноспособности и дальности полета. Так, на фюзеляжах "пешек" монтировали пару реактивных орудий РО-82 для стрельбы назад.

Часть Пе-3 оснастили качающимися установками для аэрофотоаппаратов АФА-1, а в хвостовой части мотогондол на месте бомбоотсеков разместили дополнительные бензобаки. По состоянию на 1 января 1943 г. полк располагал 11 самолетами Пе-3, что составляло 38% от боевого состава.

Впоследствии в полку постепенно стала увеличиваться доля самолетов А-20В, а численность Пе-3 уменьшилось до 3-4 единиц.