1 февраля 1950 года опытный самолет совершил перелет на аэродром ЛИИ в Жуковский. Начались заводские испытания и доводки самолета и его систем. Испытания «75» прошли сравнительно спокойно. Закончили их 30 мая того же года с положительным результатом. Сказывался опыт постройки, испытаний и доводок Ту-4 и Ту-70. В ходе испытаний на самолете летали летчики-испытатели А.И. Кабанов (генерал, начальник летной службы ОКБ), М. Мельников и др. На испытаниях экипаж самолета состоял из 6 человек. За самолетом к этому времени окончательно закрепился шифр Ту-75, под которым он и проходил испытания.

В ходе заводских испытаниях Ту-75 были зафиксированы следующие основные летно-технические данные:

Испытания закончились, но машину на государственные испытания и тем более в серию так и не передали. Причин тому было несколько. Хотя в проекте «75» ОКБ удалось добиться неплохих результатов, применив ряд оригинальных конструктивных решений, машина оказалась не ко времени. Серийные заводы, работавшие на Туполева, в том числе и казанский N 22, были загружены выше головы выпуском боевых самолетов. На ближайшее время планировалось осваивать на этих заводах серийное производство новейших стратегических межконтинентальных Ту-85, а также через два-три года - дальние реактивные бомбардировщики, которые должны были заменить в частях стремительно устаревавшие Ту-4. Тут уже было явно не до нового транспортника.

В результате командование ВВС решило временно обойтись большим парком сравнительно простых и дешевых самолетов Ил-12Т и Ли-2, а также несложной переделкой нескольких сотен Ту-4 в Ту-4Т и Ту-4ТД. На дальнюю перспективу планировалось начать работы по созданию военно-транспортных самолетов с турбореактивными и турбовинтовыми двигателями, летно-тактические характеристики которых должны были значительно превышать характеристики поршневых «транспортников». Все эти работы начали осуществлять в первой половине 50-х годов. Работы над перспективными «транспортниками» развернулись в ОКБ О.К. Антонова и в ОКБ А.Н. Туполева. Наибольших успехов достигли антоновцы, передав на вооружение во второй половине 50-х годов Ан-8 и Ан-12. Туполевцы подготовили несколько проектов военно-транспортных самолетов: «101», «107», «115», «117», «127». Причем последние четыре проекта были переделками проектов пассажирских реактивных лайнеров.

В дальнейшем, при заказах новых пассажирских самолетов, ВВС выставляли требования по оснащению их легкосъемным десантным и санитарным оборудованием (Ту-104, Ту-124, Ту-114 и Ту-134), а также по разработке сменных хвостовых модулей, дававших возможность переходить при серийном выпуске от пассажирского самолета к их военно-транспортным модификациям (проекты Ту-117, Ту-127).

Помимо проработки военно-транспортного варианта, в октябре 1949 года в ОКБ рассматривалась возможность создания на базе Ту-75 самолета-заправщика для дозаправки топливом в полете межконтинентальных стратегических бомбардировщиков Ту-85. В варианте заправщика Ту-75 должен был брать на борт 19,5 тонн топлива.

После окончания испытаний и свертывания программы создания Ту-75, самолет несколько лет эксплуатировался как грузовой в ЖЛИ и ДБ, а также привлекался для испытаний различных систем десантно-парашютного оборудования, для чего использовались фюзеляжные люки.

В 1954 году самолет разбился под Казанью. В октябре того года на нем из Москвы за двигателями АМ-3 прилетел экипаж генерала А.И. Кабанова (двигатели изготовлялись в Казани на заводе № 16). Получив двигатели, экипаж Ту-75 24 октября стартовал в Москву. Однако вскоре после взлета отказал один из двигателей. Кабанов принял решение вернуться в Казань на аэродром завода № 22.

Сели благополучно, неисправность в двигателе исправили. На следующий день 25 октября взлетели снова. Самолет ушел в облачность, но через несколько минут упал на землю и сгорел. Нескольким членам экипажа удалось покинуть самолет на парашютах, но генерал Кабанов погиб.

Так закончилась история туполевского транспортника, по многим своим техническим решениям предвосхитившего более поздние и более совершенные отечественные транспортные самолеты.